设计引物的方法技巧有哪些 不知道基因序列怎么设计引物？

设计引物的方法技巧有哪些

不知道基因序列怎么设计引物？

不知道基因序列怎么设计引物？

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。
3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。
4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在基因的编码区（CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。

诺唯赞上如何设计引物？

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

怎样根据mRNA设计引物？

先找到基因的mRNAX序列。
引物设计参数：
a
引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以设置在55-58度，beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响PCR扩增。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。