提高退火温度
oligo如何确定退火温度？
pcr出现杂带为什么要升高退火温度？
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，
同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的
Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
pcr出现杂带为什么要升高退火温度？
首先分析下是不是引物设计的问题。
其次是不是对延伸时间进行必要的优化。
第三做好阴性对照（无模板，无引物，无模板无引物）
实在不行将正确的条带切下来回收，然后作为模板，一般也应该可以扩到。
如果仍然出现杂带，那应该是扩增产物进行延伸，这里面的原理比较复杂吧，就跟那个巢式PCR似的。
PRC没什么特别的技术，理论好说，实际操作时候结果个人差别很大，建议多有优化吧。（搬运过来的）